Dopo aver frequentato, dal 1987 al 1999, la St.Georges English School of Rome, nel 2003 Stefano Masciolini consegue la maturità scientifica e successivamente si iscrive presso la facoltà di Scienze e Tecnologie Applicate. Dal 2004 al 2005 segue un corso di recitazione alla NUCT ed un altro con Gisella Burinato.
Il suo debutto d'attore avviene sul grande schermo con Le avventure acquatiche di Steve Zissou, regia di Wes Anderson, uscito in Italia nel 2005, a cui fanno seguito: K. Il bandito, regia di Martin Donovan, e Un giorno perfetto, regia di Ferzan Ozpetek, entrambi del 2008, Questo piccolo grande amore, regia di Riccardo Donna, del 2009, e Cocapop, regia di Pasquale Pozzessere, che dovrebbe uscire nelle sale nel 2010. In quest'ultimi due film interpreta rispettivamente il ruolo di Marco e Lorenzo.
Dopo aver partecipato alla serie televisiva R.I.S. Delitti Imperfetti 5, è protagonista, nel ruolo di Fiorenzo Robbiani, di una puntata di Don Matteo 6 e partecipa a Tutti pazzi per amore 2, nel ruolo di Teo. Quindi interpreta il ruolo di Vasco Lopez ne I liceali 3, regia di Francesco Miccichè, e quello di Axel nella miniserie Una bella famiglia, regia di Claudio Norza e Nanni Marino.
Inoltre nel 2009 partecipa alla sesta edizione della trasmissione televisiva Ballando con le stelle, in coppia con Alessandra Mason. Nello stesso anno è stato VJ per All Music. Nel suo curriculum vi sono anche diversi spot pubblicitari.
2012 Recitazione
2011 Recitazione
2005 Recitazione
2000 Recitazione